Обзор клинического исследования по информативности экспресс-тестов по определению антигена SARS-CoV-2

Продолжающаяся пандемия коронавирусной инфекции, вызванная SARS-CoV-2, ставит сложные задачи перед системами здравоохранения во всем мире. Эталоном для  обнаружения SARS-CoV-2 является метод амплификации нуклеиновых кислот (метод ПЦР). ПЦР в реальном времени выполняется в лабораторных условиях и требует наличия сложного оборудования, подготовленного персонала, а также развитой логистики для доставки образцов и сообщения результатов. Своевременное получение результатов крайне важно для предотвращения дальнейшего распространения вируса вследствие высокой концентрации вирусных частиц, выделяемых больным в период развития симптомов .

Ограниченность скорости работы ПЦР — лабораторий усугубляется ростом спроса на тесты ПЦР в реальном времени. Использование экспресс-тестов для обнаружения антигена SARS-CoV-2  даст возможность получать информацию своевременно о присутствии инфекции в организме, даже если в некоторых ситуациях полученные результаты потребуется дополнить результатами ПЦР. По мере появления на рынке первых промышленных тестов на антиген возрастает интерес к их характеристикам, главным образом, к их чувствительности и общей специфичности — двум важнейшим параметрам, которые определяют сферу применения тестов. SARS-CoV-2 выделяется из верхних дыхательных путей больных интенсивно в течение короткого периода времени. Если исследуемые тестируются на позднем этапе развития инфекции, например, на второй неделе после появления первых симптомов, то несовпадение результатов ПЦР в реальном времени и экспресс-тестов приведет исследователей к выводу о низкой клинической чувствительности тестовых систем. Однако картина может быть другой при использовании этих тестов для диагностики острых инфекций на раннем этапе. С практической точки зрения информации об аналитической, а не клинической, чувствительности экспресс-тестов может быть достаточно для определения их полезности для различных вариантов применения, используя ПЦР в реальном времени в качестве общепринятого эталонного метода анализа.

В биомедицинском журнале «Yale» (BMJ Yale) командой немецких авторов (Victor M. Corman, Verena Claudia Haage, Tobias Bleicker и др.) 12.11.2020г были опубликованы результаты исследования по сравнению чувствительности и специфичности семи коммерческих экспресс- тестов, предназначенных для выявления антигена SARS-CoV-2. Проанализированы экспресс- системы следующих производителей:

• Abbott Panbio™ COVID-19 Ag Rapid Test (Испания);

• RapiGEN BIOCREDIT COVID-19 Ag (Южная Корея);

• Healgen® Coronavirus Ag Rapid Test Cassette (Swab) (США);

• Coris Bioconcept Covid.19 Ag Respi-Strip (Бельгия);

• R-Biopharm RIDA®QUICK SARS-CoV-2 Antigen (Германия);

• NAL von minden NADAL COVID19-Ag Test (Германия);

• Roche/SD Biosensor SARS-CoV Rapid Antigen Test (Южная Корея). 

Результаты тестовых экспресс-систем сравнивались с результатом общепринятого анализа по методу ПЦР в реальном времени в рамках исследования в лабораторных условиях в Германии.

В тестируемые группы вошли 138 человек с подтвержденной коронавирусной инфекцией, вызванной SARS-CoV-2; 100 человек с иной респираторной вирусной инфекцией (не SARS-CoV-2) и 35 здоровых добровольцев (в качестве здоровых добровольцев выступали работники института вирусологии в возрасте от 22 лет до 61 года; средний возраст — 34,7 лет).

Авторы отмечают, что большинство производителей не включают самостоятельный анализ в свои инструкции пользователя, однако в недавнем исследовании было показано, что самостоятельный сбор образцов является надежной альтернативой профессиональному взятию мазков из носоглотки при использовании экспресс-тестов при условии строгого соблюдения  инструкции производителей теста (Lindner AK, Nikolai O, Kausch F, Wintel M, Hommes F, Gertler M, et al. Head-to-head 451 comparison of SARS-CoV-2 antigen-detecting rapid test with self-collected anterior nasal swab 452 versus professional-collected nasopharyngeal swab. medRxiv. 2020:2020.10.26.20219600). SARS-CoV- 2-положительные образцы были получены в период с марта по октябрь 2020 г.

Первоначальные сравнения аналитической чувствительности основывались на определении концентрации очищенного экспрессированного в бактериальных клетках белка нуклеокапсида вируса, который использовался в качестве мишени во всех тестах. Концентрация белка в диапазоне от 5 до 25 нг/мл обнаруживалась большинством тестов и соответствовала содержанию белка 250- 1250 нг в 50 мкл образце (RapiGEN BIOCREDIT COVID-19 Ag 50 нг/мл и 2500 нг в 50 мкл, соответственно). Для подтверждения этих значений на вирусном белке протестировали надосадочную жидкость клеточной культуры зараженных SARS-CoV-2 клеток Vero с определенными инфекционными дозами вируса, выраженными в бляшкообразующих единицах (БОЕ). Почти все тесты надежно обнаруживали примерно 44 БОЕ вируса в образце. Тесты от производителей I, III, V и VII смогли обнаружить вирус при концентрации даже в 4,4 БОЕ в каждом тесте (Abbott Panbio™ COVID-19 Ag Rapid Test, Healgen®,Coronavirus Ag Rapid Test Cassette (Swab), R-Biopharm RIDA®QUICK SARS-CoV-2 Antigen, Roche/SD Biosensor SARS-CoV Rapid Antigen Test).

Тест от производителя RapiGEN BIOCREDIT COVID-19 Ag оказался намного менее чувствительным при обнаружении как рекомбинантного белка, так и самого вируса.

Всего было протестировано 138 SARS-CoV-2-положительных (по результатам анализа ПЦР в реальном времени) образцов. Медианная вирусная нагрузка составила 2.49 X 10 ⁶ (диапазон: 1.88 X 10 ⁴ — 2.75 X 10⁹) копий на мл суспензии мазка (рисунок 1a). В зависимости от первоначального тестирования и доступного объема клинического образца использовались 115 клинических образцов для каждого оцениваемого теста (Рисунок 1b). Всего лишь 45 образцов использовались для проверки теста RapiGEN BIOCREDIT COVID-19 Ag, который правильно определил только 4 из 45 образцов, при этом в каждом из этих четырех образцов содержалось более 2 x10 ⁸ копий РНК на мл, в результате чего авторами статьи было принято решение прекратить дальнейшее определение чувствительности этого продукта. Распределение тестовых образцов показано на рисунке 1b.

Рисунок 1(ab).
а) Распределение концентрации вирусной РНК SARS-CoV-2 среди клинических образцов, использованных для проверки тестовых систем
б) Обзор протестированных образцов и соответствующих результатов для семи тест-систем (в колонке). Синие поля соответствуют положительному результату, красные поля соответствуют отрицательному результату. Пустые поля относятся к образцам, которые не были протестированы соответствующим тестом.
в) Распределение тестовых образцов

На основе этого тестирования был выполнен анализ бинарной логистической регрессии для определения 50% и 95% пределов обнаружения для каждого экспресс-теста. Без поправки на меньший объем образца в сравнении со стандартными протоколами тест- систем в данном исследовании концентрации вируса, количественно определенные с помощью ПЦР в реальном времени, при которых было достигнуто 95% совпадений, составили от 3.4 X 10⁶ до 7.41 X 10⁷ копий на мл суспензии мазка для пяти наиболее чувствительных тестов (Abbott Panbio™ COVID-19 Ag Rapid Test; Healgen®Coronavirus Ag Rapid Test Cassette (Swab); R-Biopharm RIDA®QUICK SARS-CoV-2 Antigen; NAL von minden; NADAL COVID19-Ag Test; Roche/SD Biosensor SARS-CoV Rapid Antigen Test). С поправкой на объем образца эти числа оказались ниже примерно в 8 раз.

Для определения любой систематической перекрестной реактивности с соответствующими вирусными антигенами была протестирована надосадочную жидкость культур клеток или тканей, содержащую известную концентрацию четырех эндемичных коронавирусов человека (HCoV), а также MERS- и SARS-CoV, путем внесения 50 мкл надосадочной жидкости           в лизирующий буфер каждого из экспресс- тестов). За одним исключением, которое не воспроизводилось, ни один из тестов не продемонстрировал перекрестную реактивность по отношению HCoV или MERS-CoV. SARS-CoV давал перекрестную реактивность и определялся во всех тестах.

Протестировано 100 сохраненных клинических образцов, взятых у пациентов с известными острыми инфекциями, вызванными респираторными вирусами, отличными от SARS-CoV-2: аденовирус, бокавирус, HCoV-NL63, HCoV-OC43, энтеровирус, риновирус, вирус гриппа AH1, вирус гриппа AH3, вирус гриппа В, метапневмовирус, вирус парагриппа 1,2,3, РС-вирус, микоплазма пневмония и легионелла. За одним исключением все тесты давали либо ни одного, либо один или два ложноположительных результата в 100 анализах (12 ложноположительных результатов у тест — системы Healgen®Coronavirus Ag Rapid Test Cassette (Swab)). Следует отметить, что примерно половина ложноположительных результатов воспроизводилась при повторном тестировании того же образца, при этом связь с каким-либо конкретным известным патогеном в образцах отсутствовала. Это свидетельствует о наличии какого-то фактора, не связанного с тестируемыми патогенами, вызывающего положительные сигналы тестов. Из 15 образцов, давших ложноположительные результаты, один образец вызвал положительный сигнал у двух разных тестов.

Тестирование 35 здоровых сотрудников лаборатории, не имеющих признаков инфекции дыхательных путей, показало положительные результаты у 5 человек (тест-системы Healgen®Coronavirus Ag Rapid Test Cassette (Swab); R-Biopharm RIDA®QUICK SARS-CoV-2 Antigen; NAL von minden; NADAL COVID19-Ag Test; Roche/SD Biosensor SARS-CoV Rapid Antigen Test). Все положительные результаты оказались ложноположительными по итогом немедленной проверки ПЦР в реальном времени.

Кумулятивная специфичность по результатам тестирования селективности и тестирования здоровых добровольцев составила:

• 99,26 % Abbott Panbio™ COVID-19 Ag Rapid Test;

• 100%   RapiGEN BIOCREDIT COVID-19 Ag;

• 88,24%  Healgen® Coronavirus Ag Rapid Test Cassette;

• 100%   Coris       Bioconcept         Covid.19              Ag          Respi-Strip;

• 94,85% R-Biopharm RIDA®QUICK SARS-CoV-2 Antigen;

• 99,26% NAL von minden NADAL COVID19- Ag Test ;

• 98,53% Roche/SD Biosensor SARS-CoV Rapid Antigen Test

Таким образом, по результатам проведенных исследований минимальная диагностическая концентрация вируса (предел обнаружения) в шести из семи протестированных продуктов находилась в диапазоне от 2,08 × 10 ⁶ до 2,88 × 10 ⁷ копий на мазок, в одном она составила 1,58 × 10 ¹⁰ копий на мазок. Диапазон чувствительности большинства исследуемых экспресс-тестов позволяет обнаружить вирус в первую неделю после появления симптомов COVID-19.

Специфичность варьировала от 98,53% до 100% по пяти продуктам; два экспресс-теста имели наименьшую специфичность — 94,85% и 88,24%.

Полученные ложноположительные результаты не были связаны с каким-либо конкретным респираторным агентом.

Целью данного исследования было выяснение ряда вопросов, связанных с клинической проверкой экспресс-тестов в текущей ситуации с развивающейся пандемией. Из-за быстрого изменения вирусной нагрузки в острой фазе заболевания COVID-19, у экспресс- тестов имеется узкое окно применения, которое на практике соответствует первой неделе после появления симптомов. В свете наработки опыта применения ПЦР в реальном времени в этой фазе заболевания была предпринята попытка определить аналитические характеристики тестов, т.е. установить примерную концентрацию вируса, которую могут обнаружить эти тесты, а также их склонность давать ложноположительные результаты.

Что касается чувствительности, то диапазон обнаруживаемых концентраций для большинства тестов был в пределах 1-10⁶ копий на мазок (с учетом систематического предварительного разбавления), что соответствует концентрации, которая предсказывает коэффициент изоляции вируса, равный примерно 20% в клеточной культуре. По литературным данным этот уровень успешной изоляции обычно достигался к концу первой недели после появления симптомов. Хе и др. показали, что этот момент времени также коррелирует с окончанием фактической инфективности. Момент времени в первую неделю после появления симптомов, в который результаты экспресс-теста становятся отрицательными, может служить маркером момента исчезновения инфективности. В ситуациях, характеризуемых переходом к более высокому уровню заболеваемости, немедленное получение результатов тестов может помочь появлению новых концепций в сфере здравоохранения, в рамках которых решения об изоляции или продлении изоляции будут основываться на тестировании инфективности, а не на скрининге инфекции. При первом контакте с пациентом положительный результат экспресс-теста также может помочь врачам принимать решения о немедленной изоляции лиц, для которых выявлено выделение особенно большого количества вирусных частиц. Для госпитализированных пациентов в конце курса лечения отрицательные результаты тестирования могут служить дополнительным критерием для выписки пациентов.

Скрининг бессимптомных пациентов с ожидаемым отсутствием вируса более сложен. Учитывая ограничения чувствительности, результаты тестов следует рассматривать как мгновенную оценку инфективности, а не диагноз, позволяющий исключить наличие инфекции. Из-за сильного изменения концентрации вируса в период появления симптомов или непосредственно перед ним, в рекомендациях по применению экспресс-систем следует указать, что отрицательный результат теста может быть вызван недостаточной чувствительностью теста, особенно в случаях, когда симптомы появляются сразу после тестирования. Для решения этой задачи могут служить инструкции, которые объясняют значение отрицательного результата экспресс- теста у  пациентов без признаков респираторной инфекции на момент его проведения.

Также из-за ограниченной специфичности большинства тестов для подтверждения полученных положительных результатов следует применять ПЦР в реальном времени. В данном исследовании доля ложноположительных результатов для двух тестов составила примерно 10%. Один из этих тестов (R-Biopharm) представляет собой предварительную версию рыночного продукта. У других тестов может проявляться нестабильность свойств в зависимости от партии, так как независимое исследование этих же продуктов не показало сравнимых проблем с числом ложноположительных результатов (согласно информации из вкладыша к продукту от дистрибьютора HealGen).

Выявленные проблемы со специфичностью у двух продуктов скорее всего являются временными и будут устранены путем изменения концентраций реагентом и совершенствованием технологических процессов в ближайшем будущем, возможно даже до того, как некоторые из продуктов появятся в широком доступе.

Основываясь на данных проведенного исследования представленных в биомедицинском журнале «Yale» (публикация от 12.11.2020г.), можно сделать вывод, что южно-корейский экспресс-тест фирмы SD Biosensor «Roche/SD Biosensor SARS-CoV Rapid Antigen Test» входит в перечень наиболее надежных тест-систем, демонстрируя высокую чувствительность и специфичность. Характеристика теста, с учетом погрешности исследования, о которой упоминают авторы, соответствует заявленной в инструкции производителя: чувствительность 96.52% и специфичность 99.68%.